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磁性分子印迹亚博官网首页提取-超高效液相色谱-串联质谱法测定乳及乳制品中的4 种伪蛋白

信息来源:poobuy.com??时间:2019-03-30??浏览次数:228

三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲这4 种含氮量较高且性质稳定、价格低廉的化合物被称作伪蛋白。添加到乳制品中使得蛋白质的含量远高于其实际含量,从而提高乳制品的附加值。同时,这类伪蛋白可作为动植物饲料,被广泛的应用于反刍动物饲养以及草场肥料等方面,也大大增加了其进入乳制品中的风险,严重危害人类健康,阻碍企业乃至行业的生存发展。目前食品安全国家标准规定的蛋白质测定方法为凯氏定氮法,该法通过测定氮元素的含量间接对食品中蛋白质进行定量,而不是测定蛋白质的真实值。

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东北农业大学黑龙江省绿色食品科学研究院,东北农业大学食品学院,乳品科学教育部重点实验室的单 艺、王象欣和东宁出入境检验检疫局的马 微*等人利用磁性分子印迹技术,以缩二脲-13C2和环丙氨嗪-D4为模板分子,Fe3O4为磁性纳米颗粒,制备对三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲具有特异性识别的磁性分子印迹亚博官网首页(MMIPs)。MMIPs结合同位素稀释-超高效液相色谱-串联质谱法,实现乳及乳制品中伪蛋白的特异性分离、富集和定性及定量分析。该方法快速、灵敏、准确度高,为磁性分子印迹技术在乳制品检测中的应用提供理论依据。

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1、MMIPs的合成与分子识别

本实验利用共沉淀法制备磁性Fe3O4纳米微球,与传统方法相比,采用微波进行熟化处理使得Fe3O4结晶程度提高;加入油酸和PEG-6000对其进行包裹,PEG-6000的疏水端和油酸的疏水端形成双层胶束,使磁性粒子能很好地分散在溶液中。添加PVP使Fe3O4纳米颗粒在水中洗涤几次或强力搅拌后仍能长时间稳定分散,并且放置4 个月以上没有沉淀产生。在外磁场作用下伪蛋白磁性印迹亚博官网首页迅速吸附沉降,具有很好的磁敏感性。由于三聚氰胺与环丙氨嗪有相似的化学结构,缩二脲与双氰胺也有类似化学结构,本实验选择环丙氨嗪和缩二脲的2 种同位素,即环丙氨嗪-D4和缩二脲- 13C2作为模拟印迹分子合成MMIPs,可以对4 种化合物进行特异性吸附,避免了4 种化合物之间的测定干扰。

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2、MMIPs吸附性能的测定

随着平衡浓度的增加,4 种伪蛋白被MMIPs吸附的含量显着增加,MMIPs对双氰胺、缩二脲、三聚氰胺、环丙氨嗪均具有较好的特异性吸附能力。MMIPs和MNIP对4 种伪蛋白的吸附量具有显着差异。这是由于MMIPs中形成了带有与印记分子互补且空间上固定排列的分子印迹位点,当印记分子进入“孔穴”中时,与其中的官能团发生对应的结合作用,能够更好地吸附目标分子。而对于MNIP来说,由于不具有特异性的印迹位点,其与底物产生结合作用属于物理吸附,无规律性,所以MNIP的吸附量变化不显着。

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3、色谱条件与质谱条件的选择

双氰胺、缩二脲、三聚氰胺、环丙氨嗪均属于分子结构带有氨基的有机胺类强极性化合物,所以使用ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱,亲水相互作用色谱模式(HILIC模式)对其进行分离。电喷雾电离模式为正离子模式,故在流动相中加入甲酸加强目标化合物的质子化效果。但是实验中发现0.1%甲酸和乙腈作为流动相,进行梯度洗脱时化合物峰形和线性关系均不理想,分析原因或为流动相pH值过低,因此在流动相中引入缓冲盐,使其保持相对稳定的酸度。通过实验发现,用含1%甲酸的5 mmol/L甲酸铵溶液和乙腈对待测物进行梯度洗脱时,线性关系良好、峰形明显改善。

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4、提取条件的优化

提取方式

双氰胺、缩二脲、三聚氰胺、环丙氨嗪均微溶于水,可溶于乙腈、甲醇等有机溶剂中,直接加入2 种MMIPs进行吸附,乳制品中大量的蛋白均会覆盖2 种MMIPs的表面,会影响2 种MMIPs对目标化合物的吸附。故选择乙腈-水(50∶50,V/V)预先除去大部分蛋白,再加入2 种MMIPs进行特异性吸附。

MMIPs的用量

结果显示,当2 种MMIPs添加量在20~150 mg时,4 种化合物的回收率均随着MMIPs添加量的增加而增加;当2 种MMIPs添加量大于150 mg时,4 种化合物的回收率不再增加。此4 种化合物的最小回收率为95.2%。由此得出添加150 mg 2 种MMIPs完全满足样品测定的需要。

提取时间的选择

对不同吸附时间(1~15 min)的4 种化合物的回收率进行测定。当吸附时间在1~6 min时,此4 种化合物的平均回收率从35.1%增加到95.1%,当吸附时间大于6 min时,此4 种化合物的平均回收率没有显着增加,所以确定最佳吸附时间为6 min。

清洗溶剂的选择

结果表明,使用3 mL 10%甲醇溶液对MMIPs表面进行清洗,4 种化合物回收率均比较高。

洗脱溶剂的选择

经过比较实验,本方法加入1 mL甲醇-乙酸(95∶5,V/V)溶液对4 种化合物进行洗脱,反复6 次。为了提高提取效率,洗脱时使用超声波进行辅助提取。实验结果表明,使用该洗脱方式,4 种目标化合物均可被完全洗脱。

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5、样品基质效应

在乳制品中,由于配方复杂且蛋白质等物质的存在,离子抑制十分明显。经研究采用MMIPs进行净化排除干扰物质,并结合清洗和洗脱,同时添加同位素内标抵消质谱离子化时的基质效应,从而消除了基质效应。

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6、线性范围及检出限测定结果

在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定,以待测物质量浓度(X)为横坐标,以标准品与内标物峰面积比(Y)为纵坐标绘制标准溶液工作曲线。经检测发现,三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲4 种伪蛋白各自的质量浓度与相应的峰面积比值(伪蛋白峰的面积/三聚氰胺-三胺-15N3峰面积)呈良好的线性关系,相关系数均达到0.999 0以上。

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7、回收率和精密度测定结果

结果显示,双氰胺的平均加标回收率为82.8%~95.5%,相对标准偏差为2.5%~9.2%;缩二脲的平均加标回收率为80.5%~94.2%,相对标准偏差为1.1%~7.2%;三聚氰胺的平均加标回收率为88.6%~95.6%,相对标准偏差为3.1%~6.9%;环丙氨嗪的平均加标回收率为83.5%~96.1%,相对标准偏差为2.1%~7.5%。

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8、实际样品测定结果

对市售的30 种乳制品进行分析测定,利用本方法对每个样品重复测定3 次,结果表明三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲含量均小于方法检出限。

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结 论

本实验以缩二脲-13C2和环丙氨嗪-D4为印记分子,MAA为功能单体,EGDMA为交联剂,Fe3O4为磁性组分成功制备出对三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲有特异选择吸附性能MMIPs。此外,该亚博官网首页具有很好的磁性,在完成对目标物的吸附后,可以在外加磁场作用下实现动态快速分离,使提取过程更加方便、快捷。应用超高效液相色谱-串联质谱联用技术,对提取出来的三聚氰胺、环丙氨嗪、双氰胺和缩二脲进行色谱分离、定性、定量分析,其结果准确、可靠。

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